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老師您好 我想咨詢....
老師您好 我想咨詢下細菌、大腸桿菌的檢查方法是....？我們公司請的老師教的操作讓人有所質疑，所以...拜托老師您了
咨詢者：林孝銘 咨詢時間：2007-06-13 狀態：已回復
專家 李玉成 解答表達感謝 繼續咨詢該問題 參與討論-
提供參考:飲用水中大腸桿菌快速檢測方法
【申請(專利)號】 CN200410022322.2 【專利申請日】 2004-04-14
【公開(公告)號】 CN1563422 【公開(公告)日】 2005-01-12
【主分類號】 C12Q1/68 【分類號】 C12Q1/68;C12Q1/04
【頒證日】 0000-00-00 【優先權】
【申請(專利權)人】 重慶大學 【地址】 400045重慶市沙坪壩區重慶大學生城市建設與工程學院
【發明(設計)人】 龍騰銳;馬穎;方振東;周從直 【國際申請】
【國際公布】 【進入國家日期】 0000-00-00
【專利代理機構】 重慶華科專利事務所 【代理人】 康海燕
【摘要】
本發明涉及一種飲用水大腸桿菌的快速檢測方法。應用分子生物學中的聚合酶鏈式反應，用PCR方法檢測大腸桿菌，包括以下幾個步驟：水樣中微生物的收集、微生物基因組DNA的提取、PCR擴增、產物觀察。采用上述方法與傳統方法相比，時間短，從水樣送到實驗室開始到檢測完畢，大約需要4～5個小時；靈敏度高，可以檢測到1～10個大腸桿菌/mL水樣。而傳統檢測方法至少需要48h。
【主權項】
1、飲用水中大腸桿菌快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟：(1)水樣中微生物的收集及其DNA的提取：采用滅菌后的濾膜或濾器過濾水樣，在裝有無菌水的EP管中，洗滌濾膜，離心，棄上清液，備用；(2)水樣中微生物DNA的提取：A、向EP管中加入TE緩沖液，使之重懸；B、加入SDS和蛋白酶K，混勻，溫育45min～1h；C、加入氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉入一個新EP管中；D、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉入一個新EP管中；E、加入異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，離心；F、棄上清，沉淀物用乙醇洗滌，晾干；G、將沉淀重溶于TE緩沖液，搖勻；H、用紫外分光光度計測定提取的基因組DNA模板的0D值，計算其DNA濃度，計算方法為：DNA濃度(μg/μL)＝OD值260nm×樣品稀釋倍數×50/1000I、將基因組DNA模板做好標記，貯存，備用；(3)PCR擴增；反應引物：上游引物：5’-tgttcagtggcaagagtt-3’下游引物：5’-taatcgatatacccgctc-3’50μL反應體系：10×PCR緩沖液5μLTag酶2U/μL1μLMgCl2(25mM)5μLdNTP(2.5MM)5μLddH2029μL上游引物10μM2μL上游引物10μM2μL模板DNA1.5μg/μL1μL(4)產物觀察：A、凝膠的準備：先配置瓊脂糖溶液，加熱，使其充分溶解，再加入溴化乙錠溶液；B、配置TAE電泳液；C、倒膠：將配置好的瓊脂糖溶液倒入膠板中，待其凝固后，放入電泳槽中；D、電泳：將擴增好的PCR產物與緩沖液按比例混合，加入到凝膠加樣孔中，同時加入DNA分子量標準，接通電源，設定電壓和電流，開始電泳。E、觀察；將擴增產物在紫外光下觀察，拍攝圖片。
李玉成
回復：李玉成 回復時間：2007-06-17
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